1 процентная пептонная вода как приготовить
Медицинская микробиология:
Рецепты питательных сред: мясная вода, пептонная вода, мясопептонный бульон
Рецепт 58. Мясная вода. Парную говядину или конину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. В 1,0 кг полученного фарша наливают 2000,0 мл водопроводной воды, настаивают 12-24 ч в холодильнике и кипятят на слабом огне в течение 1 ч, снимая накипь. После кипячения мясную воду остужают с целью застывания жира, после чего его удаляют.
Затем мясную воду фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют 20 мин при температуре 121 °С или дробно текучим паром. Стерильная мясная вода сохраняется длительное время. Можно обойтись и без стерилизации. В этом случае мясную воду хранят с 1-2% хлороформа (об/об) под резиновой пробкой.
Вместо мясной воды можно приготовить плацентарную воду. Для этого свежую промытую и освобожденную от оболочки человеческую плаценту пропускают через мясорубку. Фарш заливают двойным объемом воды, кипятят в течение 30 мин, фильтруют, разливают в бутыли и стерилизуют 30 мин в автоклаве при температуре 121 °С.
Мясная или плацентарная вода является основой для многих питательных сред.
Рецепт 59. Пептонная вода. Пептонную воду используют для культивирования нетребовательных микроорганизмов, а также в качестве основы среды для изучения ферментации углеводов и образования индола.
Пептон — 10,0-20,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Вода дистиллированная — 1000 мл
Навеску сухой смеси растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Устанавливают необходимое значение pH, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр до полной прозрачности. Стерилизуют при температуре 121 °С 10 мин.
Рецепт 60. Мясопептонный бульон. МПБ используют для выращивания неприхотливых микроорганизмов и как основу для приготовления сложных селективных и дифференциально-диагностических сред.
Пептон — 10,0-20,0 г
Натрия хлорид — 5,0 г
Вода мясная — 1000 мл
pH 7,2(±0,2)
Смесь вышеуказанных ингредиентов кипятят в течение 30 мин, после чего доводят уровень воды до первоначального объема. Фильтруют через бумажный фильтр. Окончательно устанавливают требуемую величину pH насыщенным раствором натрия гидрокарбоната или 10% раствором натрия гидроксида. Стерилизуют при температуре 121 °С 15-20 мин. После стерилизации в МПБ может выпадать осадок, поэтому его фильтруют вторично и снова стерилизуют. Вторичную стерилизацию производят при более низкой температуре (для предотвращения выпадения осадка).
Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 13.09.2019
Источник
Законодательная база Российской Федерации
Бесплатная горячая линия юридической помощи
Бесплатная консультация
Навигация
Федеральное законодательство
Действия
- Главная
- «ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07» (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)
| Наименование документ | «ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07» (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007) |
| Вид документа | методические указания |
| Принявший орган | роспотребнадзор |
| Номер документа | МУК 4.2.2218-07 |
| Дата принятия | 01.01.1970 |
| Дата редакции | 31.05.2007 |
| Дата регистрации в Минюсте | 01.01.1970 |
| Статус | действует |
| Публикация |
|
| Навигатор | Примечания |
7. Питательные среды, реактивы, консерванты. Порядок контроля качества питательных сред
1%-я пептонная вода, рН 8,5 +/- 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);
2%-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.
а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:
Пептон сухой — 100,0
Натрия хлорид — 50,0
Калия нитрат — 10,0
Натрия карбонат — 25,0
Дистиллированная вода — 1 л
В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5 +/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.
Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.
б) 1%-я пептонная вода.
Для получения 1%-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин. при давлении 0,7 атм.
Можно готовить 1%-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.
в) Пептонная вода с теллуритом калия.
В 1%-ю пептонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-й раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.
Плотные среды для выделения холерных вибрионов
Щелочной мясопептонный агар:
Мясная вода — 1 л
Натрия хлорид — 5,0
В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30 — 40 мин., а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.
Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2 — 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43 +/- 2) °С, лучше время отстоя продлить до 18 — 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм. 20 мин.
Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную сухую (СЭДХ).
Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12 — 18 ч формируют на этих средах плоские прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы диаметром 1,0 — 2,0 мм; V. parahaemolyticus — мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus — крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas — голубые, Enterobacteriaceae — очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.
Среды для идентификации вибрионов
а) Среды с углеводами для отбора колоний:
Натрия хлорид — 5,0
Индикатор Андреде — 40 мл
Вода дистиллированная — 1 л
Среду варят, фильтруют, разливают по 5 — 7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.
Среду можно готовить на 1,0 — 1,3%-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.
Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.
1,5 — 1,7%-й мясопептонный агар или другой
слабощелочной питательный агар — 1 л
2%-й раствор серно-кислого закисного железа — 10,0 мл
0,8%-й раствор тиосульфата натрия — 10,0 мл
0,4%-й раствор сульфата натрия — 10,0 мл
1%-й раствор фенолового красного — 24,0 мл
Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 — 7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм. и скашивают по типу среды Ресселя; рН готовой среды 7,3 +/- 0,1; цвет красный.
1,5%-й питательный агар — 1 л
Серно-кислое железо (FeSO4) — 0,2
Гипосульфит натрия (Na2SO3 х 5Н2О) — 0,08
Сульфит натрия (Na2SO3) — 0,4
0,2%-й феноловый красный — 10,0.
После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5 — 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.
6) Среды для идентификации.
К 100 мл 1%-й пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют 0,5 — 1,0% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 — 0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции — желтого цвета, при щелочной — синего.
Натрия хлорид — 5,0
Двузамещенный фосфат калия — 0,3
Бромтимоловый синий — 0,03
Дистиллированная вода — 1 л
К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2 — 3 мин. Смесь подщелачивают 20%-м раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 — 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1. При кислой реакции среда желтеет.
Двузамещенный фосфат калия — 5,0
Дистиллированная вода — 1 л.
Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.
Среда Кодама. В 1%-ю пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин. под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.
Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0 — 15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 +/- 5,0) °С. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5 — 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.
Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот
Дрожжевой экстракт — 25,0 (сухой 3,0)
Натрия хлорид — 5,0
Натрия карбонат — 0,1
(0,1%-й раствор в 20%-м спирте) — 45,0 (0,045 г сухого)
Аминокислота — 10,0 — 20,0
Дистиллированная вода — 1 л
Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую — 1% лизина, во вторую — 1% орнитина, в третью — 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1%-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1 — 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 — 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной — синеет.
Мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.
а) Для определения образования индола
Парадиметиламинобензальдегид — 1,0 г
Этиловый спирт — 95,0 мл
Концентрированная соляная кислота — 20,0 мл.
Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают, хранят в темном месте.
Полоски фильтрованной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.
б) Для выявления образования сероводорода
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.
Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска краснеет, а при образовании сероводорода полоска чернеет.
в) Для определения нитратредуктазы
Готовят отдельно два раствора. Первый — путем растворения при нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг альфа-нафтиламина (C10H7NH2). Жидкость осторожно вливают в 150 мл 12%-го раствора уксусной кислоты. Второй — 0,5 г сульфаниловой кислоты (C6H4NH2SO3H) растворяют в 150 мл 12%-й уксусной кислоты.
Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то им не пользуются.
Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и токсичность входящих в него компонентов (в частности, альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма, выращенная в бульоне или 1%-й пептонной воде с 0,1%-м KNO3, окрашивается в красный цвет.
г) Для определения бета-галактозидазной активности приготавливают М/75 раствор орто-нитрафенил — бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ):
Дистиллированная вода — 75 мл
Фосфатный буфер — 5 мл.
Растворяют в дистиллированной воде при 37 °С ОНФГ, затем добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaH2PO4 х H2O). Доводят рН до 7,0. Раствор должен быть бесцветным — хранят при температуре -4 °С. Перед использованием раствор выдерживают в течение нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде кристаллизируется.
а) Консервант с борной кислотой
Борная кислота — 40,0 г
0,9%-й раствор натрия хлорида — до 1 л.
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.
Соединяют 100 мл дефибринированной крови барана с 15 мл консерванта с борной кислотой.
б) Консервант Алсевера
Сахароза (или глюкоза) — 20,5
Хлористый натрий — 8,0
Цитрат натрия — 4,2
Дистиллированная вода — до 1,0 л.
рН — 6,1 доводится 10%-м раствором лимонной кислоты.
Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.
Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну. Консервированную кровь хранят при температуре (4 +/- 1) °С.
Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами.
Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae Р-1 (145) и Vibrio cholerae eltor М-878, а также лаборатории особо опасных инфекций учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.
Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.
На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.
Оптимальный срок проверки питательной среды 10 — 14 дней после приготовления.
При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.
Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.
При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.
При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Сроки хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.
Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:
— для щелочного агара — 6 месяцев с момента изготовления и первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль и продление срока годности еще на 3 месяца;
— для основного раствора пептона — 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1,0 — 1,5 года хранения.
Срок хранения 1%-й пептонной воды при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) — 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.
Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном прохладном месте (6 — 20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.
Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными лабораториями и противочумными учреждениями на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.
Источник